StemFit®の広場

樹立

CytoTune-iPS2.0による誘導効率

BJ細胞にCytoTune-iPS2.0各ベクターをmoi5にて感染しiPS細胞を誘導した。(A) iMatrix 511とStemFitAK03(N)を用いた場合の誘導効率は、MEFとKSRをベースにした培地を用いた場合の誘導効率と同程度であった。(B) 代表的なiPS細胞コロニー像。

本データの提供は、株式会社IDファーマ(http://www.dnavec.co.jp/jp/)です。

分化

Elixirgen Scientific, LLC

Quick-TissueTM Seriesは、転写因子を基にしたキットで、StemFit®で培養したヒトiPS細胞を主要な神経、骨格筋、血管内皮、血液、肝細胞などへ1週間で高効率に分化誘導します。再生医療向け研究を始め、疾患iPS細胞を用いた大規模創薬スクリーニングや毒性試験に本製品は利用されています。

本データの提供は、Elixirgen Scientific, LLC(https://elixirgenscientific.com)です。

EZSPHERE®(AGCテクノグラス)

方法

  1. StemFit®培地とiMatrix-511基質で培養したiPS細胞 (201B7株)を、1,000 cells/micro-wellになるようEZSPHERE type 900 へ播種してスフェロイドを作製しました。
  2. 翌日、神経幹細胞分化培地に置換して、3日間培養しました。

短期間で高純度のヒトiPS細胞の神経幹細胞分化
~StemFit®培地と微細加工培養容器(EZSPHERE®)の組合せ~

均一なスフェロイド作製

微細加工容器EZSPHERE®は細胞培養容器の培養面に微細な穴(micro-well)が施されています。StemFit®を使い、かつEZSPHERE®を活用することで、大きさが均一なスフェロイドが作製できました。

EZSPHERE®上での神経幹細胞分化

分化には作製されたスフェロイドの品質(大きさなど)が重要です。本手法により、短期間で高純度の神経幹細胞(N-cadherin、CD56ダブルポジティブ)が作製されました。

本研究は、AMEDの「再生医療実現拠点ネットワークプログラム」の一環として行われました。

引用

Hiroki Sato, et al., Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.
Scientific Reports 6. 31063 (2016)

EZSPHERE® ウェブサイトリンク(AGCテクノグラス) http://www.atgc.co.jp/div/rika/hbin/ez2012.html

大量培養

ABLE社製100mL,30mLリアクター

本製品は、「再生医療の産業化に向けたシステムインテグレーション-臓器ファクトリーの創生-(中心研究者:東京女子医科大学岡野光夫教授)」により、日本学術振興会を通して助成された研究の成果です。

iPS細胞培養用シングルユースバイオリアクターは、デルタ型撹拌翼により、細胞凝集塊を効率よく浮遊させ、分化誘導に最適な均質な細胞凝集塊を効率よく得ることができます。 また、低接着ディッシュの振とうによる浮遊撹拌培養に比べて安定した培養結果が得られ、接着培養に比べて培地量や培地交換作業時間などのコストを削減できます。

本データの提供は、エイブル株式会社(http://www.able-biott.co.jp/bioreactor.html)です。

受託試験

SNLフィーダー上の201B7株と1201C1株、Feeder-Free(StemFit®/ iMatrix-511)培養での同2株を、それぞれの培養条件で3回継代した後に、KSR培地、非接着U型96wellプレートにて7日間培養し、浮遊状態にて形成されたEB(胚葉体)を位相差顕微鏡で撮影した。
形成させたEBサンプルの分化マーカー発現をqRT-PCRにて解析し、三胚葉に分化していることを確認した。

本データは、味の素(株)が、(株)iPSポータル(http://ipsportal.com/)に委託して実施したものです。

スフェロイド培養

Elplasia®を用いたiPS未分化細胞のスフェロイド培養

Materials & Method

  • 培養プレート:Elplasia® RB 500 400 NA 6(クラレ)
    培養プレート:Elplasia® RB 500 400 NA 6(クラレ)
  • 培地:StemFit® AK02N(味の素株式会社 製)
  • 細胞:201B7, 1231A3

1.iPS細胞(201B7および1231A3株)をRB 500 400 NA 6に細胞数75,000 cells/wellとなるよう播種した。

  • RB 500 400 NA 6のmicro-pattern数:約3,000個
  • micro-patternあたりの細胞数:約25個
  • 培地量:3 mL/well

2.細胞播種したプレートをインキュベーター内で7日間培養した。

  • 培地交換: 細胞播種から1日目(播種翌日)と4日目、および6日目に実施。培地交換時にスフェロイドがmicro-patternから離脱するのを抑制するため、培地は半量(1.5mL)交換とした。

3.播種から1、4、6および7日目にウェル内3か所を撮影(1枚の画像に含まれるmicro-pattern数は6個)し、取得した画像からスフェロイドのサイズ(最大直径)を測定した。

4.播種から7日目にスフェロイドを回収し、トリプシン処理して単細胞化し、増殖率、Nanogおよびoct3/4の発現を評価した。また、一部を用い、継代を行った。

5.新しい培養プレートに手順1と同じ操作で細胞を播種し、手順2・3を繰り返すことで、合計2回の継代操作、延べ21日間のスフェロイド培養、スフェロイドの評価を行った。

Results

  • Elplasia®に播種されたiPS細胞は、培養1日目に各micro-pattern内に一つスフェロイドを形成し、培養を続けるにつれスフェロイドは大きくなっていった(図1)。
  • 培養1日目のスフェロイド直径は平均約50 μmであり、培養7日目には平均145 μmになった(図2)。
  • スフェロイド直径は、培養期間を通じて変動係数(標準偏差/平均値)は約10%であった。
  • 培養7日目、14日目、21日目に回収した細胞について、NanogおよびOct3/4の発現が維持されていることを確認した。
  • 細胞株201B7においても、同様の傾向が得られた。

Elplasia®で培養したスフェロイドの顕微観察像(1231A3株)

スフェロイド直径の経時変化(1231A3株)

お問い合わせ先

株式会社クラレ 成形部材事業推進部 マイクロデバイス開発チーム
Tel: 029-853-1569
Fax: 029-853-1545
E-mail: elplasia.3d@kuraray.com
Web site: http://www.elplasia.com/

細胞凍結

STEM-CELLBANKER® & StemFit®

STEM-CELLBANKER® & StemFit®

StemFit®AK03N 培地で培養したiPS細胞を用いて、STEM-CELLBANKER® GMP grade凍結保存試験を行い、融解時の生存率及び増殖性の確認を行ったところ、融解時の生存率も良好であり、1日後の付着性及び5日後の増殖性も全く問題を認めなかった

  • StemFit®AK03N 培地で数継代培養したiPS細胞を使用
  • 培養方法及び凍結保存、凍結ストックの融解については、CiRA標準プロトコールを用いて実施(CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310)
  • 細胞外マトリックス:iMatrixi-511(ニッピ)
    凍結保存:プログラムディープフリーザー(ストレックス株式会社)PDF-2000

本データの提供はゼノアック・リソース株式会社です http://www.zenoaq.jp/cellbanker/ja/stem-cellbanker.html