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iPS細胞の培養

フィーダーフリー培養

フィーダー細胞を用いずにiPS細胞を培養する方法です。iPS細胞は当初はオンフィーダー培養(マウス細胞上での培養)で培養されていましたが、再生医療に用いるためにはフィーダー細胞やその他の動物由来成分を使用しないことが望ましいため、徐々にフィーダーフリー培養が主流になりつつあります。
ここでStemFit®AK02N培地、iMatrix-511を用いてフィーダーフリーで培養し凍結保存する方法をご紹介します。

1継代

継代① プレートと培地の用意

継代② 継代

使用する機器・試薬など

操作ポイント

【コーティング時】
iMatrix-511を0.3~0.5 μg/ cm2となるように添加します。
iMatrix-511はプレートへの接着性が高いため、iMatrix-511添加後に素早く混ぜます。Well数が多い場合は、iMatrix-511/PBS溶液を50 ml Tube等でまとめて作製することもできます。乾燥しないように注意します。

【継代前準備】
StemFit培地を50 mlチューブ等に分注し、Y-27632を10 μMとなるよう添加します。Y-27632の添加忘れや培地の取り違えを防ぐため、添加後にはチューブに(+Y-27632)などと記載し、培養記録簿にもチェックします。

【継代時】
継代予定の細胞を観察し、分化細胞(iPS細胞ではなくなったと判断した細胞)を顕微鏡観察下で油性マーカーによるマーキングを行います。アスピレータ―の先端にフィルター無しチップをつけ、マーキングした箇所を吸引除去します。吸引箇所が多い場合は、数箇所程度吸引毎にwellを反転させ、細胞が乾燥しないようにします。

【酵素処理】
0.5 x TrypLE溶液処理3分経過後、顕微鏡観察を行いコロニー全体が白くなっていることを確認します。0.5 x TrypLE処理は4分以内に留め、PBS洗浄後はY-27632添加培地を入れ、剥離します。

【翌日培地交換】
継代時の培地にはY-27632が含まれているため、継代翌日の培地交換は、22時間~26時間の範囲での実施を推奨します。培地交換が早すぎると、培地交換後の生存率が低下し、培地交換が遅すぎるとiPS細胞の形態が変化します。

※本内容は皆様が実験・研究をされる際の参考として掲載しているものです。結果を保証するものではありません。


2凍結

凍結① 凍結の準備

凍結② 細胞の凍結

使用する機器・試薬など

操作ポイント

【凍結時】
凍結予定の細胞を観察し、分化細胞(iPS細胞ではなくなったと判断した細胞)を顕微鏡観察下で油性マーカーによるマーキングを行います。アスピレータ―の先端にフィルター無しチップをつけ、マーキングした箇所を吸引除去します。吸引箇所が多い場合は、数箇所程度吸引毎にwellを反転させ、細胞が乾燥しないようにします。

【酵素処理・剥離】
0.5 x TrypLE溶液処理3分経過後、顕微鏡観察を行いコロニー全体が白くなっていることを確認します。0.5 x TrypLE処理は4分以内に留め、PBS洗浄後はY27632添加培地を入れ、剥離します。剥離するWell数が多い場合は、0.5 x TrypLE処理、PBSで洗浄後に、Y27632添加培地を入れた状態でCO2インキュベータへ入れておき、まとめて剥離します。

【細胞の凍結】
遠心後、全ての細胞を凍結液 (STEM-CELLBANKER)へ懸濁します。凍結チューブへの分注後、凍結専用容器へ移し、-80℃フリーザーへ格納します。凍結液への懸濁から-80℃への格納までの操作を30分以内に行います。

※本内容は皆様が実験・研究をされる際の参考として掲載しているものです。結果を保証するものではありません。


オンフィーダー培養

フィーダー細胞(マウス線維芽細胞)を用いてiPS細胞を培養する方法です。
マイトマイシン処理などを行い分裂を出来なくしたフィーダー細胞をディッシュに撒いておき、その上にiPS細胞をのせ培養する方法です。

工事中です。


トピックス‐iPS細胞培養体験研修

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